Flow cytometry adalah metode analisis sel throughput tinggi yang menggunakan sistem aliran yang dirancang dengan hati-hati untuk melewati sel atau partikel lain dalam satu file oleh detektor laser, yang memungkinkan ukuran dan keadaan sel disimpulkan oleh waktu transisi dan kepadatan optik.
Teknik lain, seperti mikroskop fluoresensi, sering dimasukkan ke dalam alat flow cytometry, memungkinkan banyak fitur seluler ditandai dengan beberapa probe fluoresen dengan panjang gelombang berbeda secara bersamaan, kemudian diukur dengan intensitas emisi pada panjang gelombang yang sesuai. Sebagai contoh, proporsi relatif dari dua protein seluler dapat dibandingkan, atau keberhasilan aksi obat dikonfirmasi oleh adanya fluoresensi.
Untuk apa tes flow cytometry dan proliferasi sel digunakan?
Tes proliferasi sel biasanya dilakukan dalam pelat kultur sel di mana sejumlah sel yang diketahui diinkubasi dengan konsentrasi obat atau senyawa aktif lain yang diketahui dan dibandingkan dengan sel yang telah dikultur dalam kondisi yang identik tetapi belum terpapar obat untuk bertindak sebagai sebuah kontrol. Hal ini memungkinkan pengaruh obat pada pertumbuhan dan proliferasi sel ditentukan dengan menghitung jumlah sel di setiap sumur setelah periode tertentu, biasanya setara dengan waktu yang diharapkan sel kontrol mencapai pertemuan di sumur mereka, mengingat jumlah sel yang digunakan Begitu sel tumbuh untuk mengisi ruang yang tersedia, mereka menjadi konfluen, dan kecepatan pertumbuhannya menurun, dan dengan demikian jumlah sel mencapai batas, dan proliferasi menurun.
Daripada mencoba menghitung sel secara langsung dalam sumur kontrol atau sampel, pewarna yang diaktifkan oleh proses seluler metabolik digunakan dalam jenis uji proliferasi sel yang paling umum. Sebagai contoh, selama uji proliferasi sel 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) reduksi tetrazolium (MTT) kristal tetrazolium yang tidak larut dalam air dihasilkan oleh interaksi pewarna dengan proses metabolisme seluler. , dan setelah inkubasi dengan pewarna, kristal dilarutkan dalam DMSO untuk menghasilkan larutan berwarna, di mana kerapatan optik sebanding dengan konsentrasi kristal MTT, dan dengan demikian tingkat aktivitas metabolisme yang terjadi, dan jumlah sel yang layak. di dalam sumur.
Sebagian besar pengujian viabilitas sel secara inheren merusak sel, dan flow cytometry mewakili metode analisis dan penyortiran sel yang berpotensi tidak merusak. Setelah inkubasi dengan obat atau toksin yang sedang diselidiki, sel dapat dikumpulkan dan diwarnai untuk menunjukkan viabilitas dan kemudian dimasukkan ke dalam alat flow cytometry, menyimpulkan sitotoksisitas dari jumlah sel. Seperti yang telah dibahas, beberapa tag fluoresen dapat dimuat secara bersamaan ke sel dan menandakan jumlah relatif dari struktur targetnya, dan sel disortir berdasarkan intensitas relatif fluoresensi yang terdeteksi untuk pemeriksaan lebih lanjut.
Setelah uji proliferasi sel, spektroskopi fluoresensi sering digunakan untuk mengungkap detail mengenai keadaan sel dan mekanisme kerja terapi yang sedang diselidiki, di mana mereka dapat diperiksa in situ dan dengan resolusi tinggi. Karena sifat throughput sitometri aliran fluoresensi yang tinggi, paling baik digunakan untuk mengungkapkan tren keseluruhan dalam populasi sel, seperti tahap siklus sel dan populasi mitokondria, di mana mikroskop fluoresensi khusus yang lebih rinci tetap atau in situsel hidup dapat dilakukan baik secara langsung mengikuti uji proliferasi sel atau setelah disortir dengan flow cytometry. Sel juga dapat diamati dengan sangat rinci dengan memindai mikroskop elektron selama dan setelah tes proliferasi sel, sehingga morfologi seluler dan karakteristik lain dapat diperiksa.